Técnicas de identificación hematológicas

TECNICAS DE IDENTIFICACIÓN
TECNICA DE LA BENCIDINA O DE ADLER

1. Preparación del reactivo

a) Solución de Bencidina
0.25 gr de bencidina se disuelven en 175 ml de etanol y se añaden de 5 a 10 gotas de ácido acético glacial. Se guarda en un frasco gotero ámbar, en refrigeración mientras no se usa.

b) Peróxido de hidrógeno al 3%, en frasco gotero ámbar.

1. Procedimiento

Humedecer un hisopo con agua destilada y frotarlo sobre la mancha problema.

Añadir al hisopo 1 o 2 gotas de solución de bencidina, después de unos momentos de observar que no dé coloración con ésta, poner la misma cantidad de peróxido de hidrógeno sobre el hisopo.

1. Interpretación de resultados

En caso positivo aparecerá una coloración azul intenso.

TÉCNICA DE FENOLFTALEÍNA

1. Preparación del reactivo

a) Solución de Fenolftaleína
Fenolftaleína 2 gr
Hidróxido de potasio 20 gr
Agua destilada 100 ml
Polvo de zinc 20 gr

Disolver estas sustancias y colocarlas a reflujo con el polvo de zinc hasta completar decoloración. Esta solución madre deberá guardarse en un frasco ámbar en refrigeración y deberá añadirse polvo de zinc.

b) Solución de trabajo
Diluír la solución madre en etanol en la proporción de 1:5, la que también deberá refrigerarse mientras no se use.

c) Solución de peróxido de hidrógeno al 3%.

2. Procedimiento

Humedecer un hisopo con agua destilada, frotarlo sobre la mancha problema y pasarlo a un tubo de ensayo con 2 ml de la misma solución, calentar un minuto a 100 °C, añadir unas gotas de solución de trabajo, esperar unos segundos y agregar agua oxigenada.

1. Interpretación de resultados

En caso positivo aparecerá una coloración rosa brillante.

TÉCNICA DE LA LEUCO MALAQUITA VERDE

1. Preparación del reactivo

a) Se prepara una mezcla sólida que contenga:

0.32 gr de perborato de sodio y 0.10 gr de malaquita verde, se mezclan perfectamente y se guardan en frasco ámbar. Esta mezcla dura un año sin perder su estabilidad.

b) El solvente se prepara diluyendo 6.6 ml de ácido acético glacial en 3.3 ml de agua destilada.

c) Preparar el reactivo de trabajo, inmediatamente antes de usarlo, disolviendo la mezcla sólida a) en la solución b). Si en el reactivo recién preparado llegara a observarse la más leve coloración verde, no deberá ser usado.

2. Procedimiento

La mancha sospechosa se levanta con hisopo humedecido en agua destilada y se le agregan unas gotas del reactivo recientemente preparado.

3. Interpretación de resultados

En caso positivo se observará una coloración verde.

TÉCNICAS ESPECTROSCÓPICAS

En la práctica forense cotidiana en el laboratorio se ha comprobado que una mancha es de sangre con una metodología espectroscópica mucho muy simple y rápida:

1.- Impregnar un pequeño trozo de 5 x 5 mm de tela limpia, sin apresto, de color blanco con la muestra problema.

2.- Colocar la muestra así obtenida en un tubo de ensayo y añadirle 5 ml de agua destilada, dejándola reposar durante 10 minutos para lograr una eficiente extracción: pasado ese tiempo, filtrar.

3.- Efectuar el barrido espectral en la zona del espectro visible; se obtendrán tres bandas de absorción: dos finas a 575 y 540 nm y una banda ancha a 412 nm. Este espectro corresponde a la oxihemoglobina.

4.- Efectuar nuevamente la extracción de la muestra problema como se indica en el punto 2, pero utilizando en vez de agua destilada, 5 ml de una solución de ferricianuro de potasio al 0.5%. Al realizar el barrido espectral en la región del visible, se obtendrá una banda a 630 nm, banda que corresponderá a la metahemoglobina.

5.- Sobre la misma celda de muestra , añadir unos gránulos de cianuro de potasio; al efectuar el barrido espectroscópico, deberá desaparecer la banda de la longitud de onda correspondiente a 630 nm y se obtendrá una banda a 540 nm, debida a la formación de cianometahemoglobina.

NOTA. Para realizar estas experiencias se utiliza un espectrofotómetro Ultravioleta-visible.

TECNICAS DE CONFIRMACIÓN

CRISTALES DE HEMINA O CRISTALES DE TEICHMAN

1. Preparación del reactivo
Cloruro de sodio 0.1 gr
Bromuro de potasio 0.1 gr
Ioduro de potasio 0.1 gr
Acido acético c.b.p. 100 ml

2. Procedimiento

a) Colocar la muestra problema en el centro de una laminilla de vidrio y poner encima de ella un cubreobjetos.
b) Deslizar entre lámina y laminilla, por capilaridad, unas gotas del reactivo de Teichmann.
c) Calentar lentamente y a baja temperatura la laminilla hasta la evaporación.
d) Dejar enfriar y observar al microscopio.

3. Interpretación de resultados

En caso positivo se observarán cristales romboidales de color café oscuro.

PRUEBA DE TAKAYAMA (HEMOCROMÓGENO)

1. Preparación del reactivo

Mezclar:

Una parte de solución saturada de glucosa
Una parte de solución de hidróxido de sodio al 10 %
Una parte de piridina
Dos partes de agua destilada

Una vez preparada la mezcla se guarda en frasco ámbar. La solución deberá ser preparada inmediatamente antes de utilizarse.

2. Procedimiento

a) Colocar una pequeña cantidad de muestra problema entre una laminilla portaobjetos y un cubreobjetos.
b) Deslizar por capilaridad unas gotas del reactivo entre laminilla y laminilla.
c) Calentar la laminilla a baja temperatura durante 30 segundos.
d) Observar al microscopio.

3. Interpretación de resultados

En caso positivo se observarán cristales romboidales de color rosa alrededor de la muestra.

TECNICAS PARA LA DETERMINACIÓN DEL ORIGEN DE LA SANGRE
TECNICAS DE LAS PRECIPITINAS EN CAPILAR

a) Reactivos

1) Antisuero humano precipitante
2) Solución salina fisiológica

b) Procedimiento

1. Cortar un pequeño fragmento de la mancha y extraer en un tubo de ensayo con unas gotas de solución salina fisiológica; el tiempo requerido dependerá de la naturaleza de la mancha; normalmente se requieren de 1 a 2 minutos. Si la solución está turbia es conveniente centrifugar y utilizar el sobrenadante.
2. Dos gotas del extracto diluido se colocan en un tubo capilar (de tal forma que el líquido humedezca la pared del tubo por lo cual es preferible hacer esto con el capilar inclinado). Una cantidad igual de antisuero se absorbe en el mismo capilar de manera que quede debajo de la muestra. El tubo se fija perpendicularmente sobre un soporte. La observación se hace con luz indirecta y sobre fondo oscuro, la aparición de un anillote precipitación en la interfase de los dos líquidos indica reacción positiva.

c) Interpretación de resultados

El resultado se considerará positivo si la precipitación aparece antes de 20 minutos, después de ese tiempo el resultado deja de ser confiable.

DETERMINACIÓN DE GRUPO SANGUÍNEO EN SANGRE FRESCA Y EN MANCHAS DE SANGRE SECA CON FINES FORENSES.
DETERMINACIÓN DE GRUPO SANGUÍNEO EN SANGRE FRESCA
RECOLECCIÓN Y PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS SUJETAS A ESTUDIO

1. EN PERSONAS VIVAS

a) Tomar 5 ml de sangre venosa con una jeringa estéril.
b) Separar el plasma por centrifugación.
c) Hacer una suspensión del paquete globular al 2% en el propio plasma de la muestra tomada, para efectuar determinaciones en tubo de ensayo y al 5% para determinación en placa.

1. EN CADÁVERES

a) Tomar 5 ml de sangre de una arteria o vaso grueso o bien de la cavidad cardíaca teniendo cuidado de que no se contamine con tejido adiposo del propio cadáver .
b) Separar el paquete globular por centrifugación.
c) Lavar el paquete globular tres veces con solución salina fría, fresca y estéril (por lavar glóbulos rojos se entiende: depositar una pequeña cantidad de glóbulos rojos en el fondo de un tubo; llenarlo con solución salina; mezclar invirtiendo el tubo suavemente varias veces, centrifugar y desechar el sobrenadante).

MATERIAL EMPLEADO

· Centrífuga calibrada a 3,400 r.p.m.
· Tubos de ensayo
· Placas hemoclasificadoras
· Pipetas Pasteur
· Bulbos de goma
· Aplicadores de madera
· Solución salina fresca y estéril (8.5 gr de cloruro de sodio disueltos en 1,000 ml de agua destilada).
· Suero humano hemoclasificador:

Anti-A
Anti-B
Anti-Rh

DETERMINACIÓN DEL GRUPO SANGUÍNEO EN PLACA

1. Preparar suspensiones de eritrocitos al 5% en solución salina.
2. Colocar sobre una placa para determinación de grupo sanguíneo, una gota de Anti-A, Anti-B y Anti-Rh, en cada círculo, anotando previamente en la parte superior del círculo A, B y Rh.
3. Añadir, sin mezclar y a un lado de las gotas de antisueros, una gota de suspensión de eritrocitos al 5%.
4. Mezclar la suspensión de eritrocitos con la ayuda de un aplicador de madera, con cada uno de los antisueros previamente colocados.
5. Observar macroscópicamente la presencia o ausencia de aglutinación a los 30 segundos.

INTERPRETACIÓN

Si se observa aglutinación en el círculo A, la sangre corresponde al grupo A.
Si se observa en el círculo B, la sangre será grupo B.
Si se observa aglutinación en los círculos A y B, el grupo será AB.
Si no se observa aglutinación ni en el círculo A ni en el B, el grupo será O
Si se observa aglutinación en el círculo Rh, la sangre corresponde al factor Rh positivo, si no es Rh negativo.

DETERMINACIÓN DE GRUPO SANGUÍNEO EN SANGRE SECA
TÉCNICA DE ABSORCIÓN – ELUCIÓN

MATERIAL EMPLEADO

1. Sueros hemoclasificadores Anti-A y Anti-B.
2. Metanol
3. Na2HPO4.
4. KH2PO4
5. NaCl
6. Tubos de ensayo
7. Pipetas Pasteur
8. Bulbos de goma
9. Tijeras
10. Aplicadores de madera
11. Guantes desechables
12. Tela estéril y sin apresto, de algodón
13. Gradillas para tubos de ensayo
14. Refrigerador
15. Centrífuga
16. Baño María a temperatura constante
17. Horno

REACTIVOS

1. Buffer salino

a) Solución de Na2HPO4 (9.47 gr/lt)
b) Solución de KH2PO4 (9.08 gr/lt)

1. Buffer final
A 72 ml de la solución a), añadir 50 ml de la solución b) y 8.5 gr de cloruro de sodio, aforar a 1,000 ml en matraz volumétrico (pH de 7.2).

1. Preparación de los antisueros

Los antisueros anti-A y Anti-B, se diluyen de la siguiente manera: a 1 ml de antisuero, se añaden 10 ml de solución Buffer final.

PROCEDIMIENTO

1. Cortar cuatro fragmentos de tela impregnada con sangre problema, que medirán 3 x 3 mm (cuando la mancha problema no se encuentre sobre tela, absorberla con solución salina en pequeños trozos de tela de algodón color blanco, sin apresto y esterilizada, que en caso necesario puede secarse en la estufa) y colocar cada recorte en los tubos necesarios.
2. Los tubos se colocan en una misma columna de una gradilla, columna que se marcará como problema.
3. En la forma antes descrita se prepara otra serie de tubos en cuyo interior se colocarán fragmentos de tela manchados con sangre de grupo conocido: A, B, AB y O, marcándose tal columna como testigo.
4. Se coloca otra serie de tubos que contengan fragmentos de una parte de tela en estudio, que no se encuentre maculada con sangre y se pondrán en una tercera columna señalada como control.
5. Fijar las manchas de sangre impregnadas en la tela, cubriéndolas con metanol cuando menos durante 15 minutos. Después de ese tiempo eliminarlo totalmente.
6. Agregar a cada tubo de la hilera Anti-A, dos gotas de suero anti-A; a los de la hilera Anti-B, suero Anti-B.
7. Dejar en refrigeración durante toda la noche a 4°C.
8. Después de ese tiempo, lavar con solución salina fría 6 veces o hasta obtener una solución clara e incolora.
9. Añadir a cada tubo dos gotas de solución salina a temperatura ambiente.
10. Colocar la gradilla en el baño maría a 56 °C durante 10 o 15 minutos.
11. Sacar cuidadosamente los trozos de tela con un aplicador de madera, diferente para cada tubo.
12. Agregar una gota de glóbulos lavados a 2%:

Del grupo A a los tubos de la hilera A
Del grupo B a los tubos de la hilera B

(problemas, control y testigos)

1. Centrifugar durante 30 segundos a 3,400 rpm.
2. Observar si existe o no aglutinación.

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

1. Si hay aglutinación en el tubo problema de la hilera marcada como Anti-A, el grupo corresponderá a A.
2. Si hay aglutinación en el tubo problema de la hilera marcada como Anti-B, el grupo corresponderá a B.
3. Si hay aglutinación en ambos el grupo será AB.
4. Si no se observa aglutinación en ningún tubo, el grupo será O.